全國客戶服務(wù)電話
0411-62910999
導(dǎo)航
導(dǎo)航
原創(chuàng) 李輝 科學(xué)大院 11月16日 開篇詞：
放線菌能產(chǎn)生抗生素，釀酒酵母能釀出美酒、藻類還能生產(chǎn)被譽為腦黃金的DHA……小小的微生物，能夠生產(chǎn)出各種各樣化合物，變成人類社會中的健康守護者（藥品）、能量之源（燃料）、情緒催化劑（酒精）……而如果有了生物工程師的介入，微生物可以變得更強，“變身”成“細胞工廠”，為人類謀求更大的福利。 先進的微生物細胞工廠，可以讓人類獲得更加廉價的化學(xué)品。而工程師的技術(shù)越先進，某種程度上代表國家在生物技術(shù)領(lǐng)域的競爭力越強。 那么，工程師是如何打造微生物細胞工廠呢？各個環(huán)節(jié)會使用到哪些新技術(shù)？現(xiàn)在真的已經(jīng)有這樣的細胞工廠了嗎？大院er和生物工程師們推出了微生物“智”造專題，我們將為你講述這些“工廠”里的故事。
中國科學(xué)院有一位“億元教授”，在國外完成學(xué)業(yè)后回國組建實驗室。他開發(fā)出一種比較先進的能夠產(chǎn)L-丙氨酸的“工廠”。技術(shù)轉(zhuǎn)讓后，企業(yè)迅速憑借他打造的“工廠”打敗諸多跨國大企業(yè)，將自己的市場占有率從18%提高到80%，也帶動形成一個全新的產(chǎn)業(yè)鏈。而隨著企業(yè)的上市，這位老師也順利跨入了“億元教授”俱樂部。同時，從生產(chǎn)者到消費者，很多人也因為這個工廠而受益（對此感興趣的小伙伴可以搜索第一條參考文獻~）。
上面說到的“工廠”是啥？
區(qū)別于我們一般認知中的工廠，這類“工廠”它其貌不揚，沒有大煙囪，也沒有機械化的流水線，“占地”僅僅在零點幾到幾百微米之間，但是它們的產(chǎn)品卻是千家萬戶生活中的必備之物，誰擁有了建造這些工廠的先進技術(shù)，誰就擁有了更強的造福社會的能力以及源源不斷的財源。
這里所說的“工廠”其實是微生物。微生物之所以能夠被當作“細胞工廠”，一是因為它們能夠產(chǎn)生各種各樣對人類有益的化學(xué)品，而這些化學(xué)品目前已被廣泛應(yīng)用到了包括食品、藥品、農(nóng)業(yè)及能源等眾多領(lǐng)域，二是因為存在一些可以被稱作生物工程師的人，這些人的工作就是去創(chuàng)造或強化微生物生產(chǎn)化學(xué)品的能力，正是他們的存在，才使得微生物對人類有益的特性能夠被無限放大，從而對人類社會產(chǎn)生實質(zhì)性的影響。
既然微生物細胞工廠這么多金，那要靠它走上致富的道路需要經(jīng)歷什么呢？以下的這六個階段是必經(jīng)之路。
第一階段：利潤和能力的匹配
建造微生物細胞工廠，面對的第一個問題是用它產(chǎn)什么化合物？
單純從賺錢策略的角度來看，細胞工廠所產(chǎn)的化合物可以分為兩類。
一類是薄利多銷型化合物，又稱作大宗化學(xué)品，這類化學(xué)品的特點是結(jié)構(gòu)簡單、價格低廉并且社會和市場對它們存在巨大的需求，比如能被用作燃料的乙醇和丁醇就是其中典型的例子。
另一類是“一單回本”型化合物，又稱作精細化學(xué)品，這類化學(xué)品結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價格昂貴，且一般沒有成熟的化學(xué)合成路線或合成成本太高。這類產(chǎn)品通常被應(yīng)用于醫(yī)藥或者化妝品領(lǐng)域，來源于馬達加斯加長春花中的長春新堿就是一個典型的例子，長春新堿是一種潛在的抗癌化療藥物，從長春花中提取一盎司（28.3g）的量就需要一噸的長春花，花費將近100萬人民幣。
長春花及長春新堿（圖片來源：Veer圖庫、維基百科）
第二階段：讓合適的微生物去產(chǎn)
正確的化合物
選好產(chǎn)品之后，接下來的第二個問題是把目標化合物放到哪種底盤微生物中去生產(chǎn)？其實挑底盤微生物這件事，優(yōu)秀的工程師和優(yōu)秀的教師的理念有相似之處，好的老師會對不同的學(xué)生因材施教，而好的工程師也懂得選擇合適的微生物去生產(chǎn)它所擅長生產(chǎn)的化合物，他們能夠憑借兩方面的經(jīng)驗選出合適的底盤微生物。
一方面是對不同微生物先天優(yōu)勢的了解，比如梭菌（Clostridium sp.）比較適合生產(chǎn)可以用作化工原料的丙酮和丁醇；棒桿菌屬（Corynebacterium sp.）的微生物比較適合生產(chǎn)氨基酸；不透明紅球菌（Rhodococcus opacus）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）適合生產(chǎn)脂類、脂肪酸和其衍生物；而放線菌（Actinomycetes）則適合生產(chǎn)抗生素和聚酮類化合物。
左右滑動查看多圖，從左到右依次為梭菌、棒桿菌、解脂耶氏酵母、放線菌（圖片來源：Science Photo Library及Marizeth Groenewald et al., 2014）
另一面是對不同微生物安全性的了解。有些由微生物產(chǎn)生的化學(xué)品是會直接被人類食用或者使用的，比如日常生活中的調(diào)味品和會直接涂抹到肌膚表面的化妝品。如果要生產(chǎn)這類化合物，工程師一般則會選擇所謂的公認安全（GRAS：generally recognized as safe）的微生物作為底盤：釀酒酵母（S. cerevisiae）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、谷棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum)、 乳酸菌（Lactic acid bacteria）和惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida KT2440）都是比較有名氣的GRAS微生物。
三種明星GRAS微生物（左右滑動查看多圖，從左到右依次為釀酒酵母、芽孢桿菌、乳酸菌丨圖片來源：維基百科、American Biosystems、2018 Dr.Horst Neve）
第三階段：設(shè)計化學(xué)品的“生產(chǎn)線”
底盤選好就可以設(shè)計針對目標化合物的生產(chǎn)線了，所謂生產(chǎn)線，就是生產(chǎn)原料經(jīng)微生物代謝后轉(zhuǎn)化成目標化合物的途徑，這些代謝途徑的設(shè)計，根據(jù)難易程度的不同可以分成三個級別：
入門級設(shè)計的理念是沒有設(shè)計，在這種情況下所選的底盤中恰好就有能產(chǎn)目標化合物的代謝途徑，比如釀酒酵母本來就能將葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙醇，用它產(chǎn)乙醇，在開始階段就不用費太多精力。
中級設(shè)計的理念是“移花接木”，其實也就是從其它物種中“抄答案”，借鑒得越多，對工程師的技術(shù)要求越高。
前兩年，首爾大學(xué)的工程師們想用釀酒酵母去生產(chǎn)一種能吸收紫外線的化合物-類菌孢素氨基酸（MAA），釀酒酵母自己本身不能生產(chǎn)MAA，但藍細菌可以。于是她們利用基因編輯技術(shù)，把藍細菌中的四個基因人為的在釀酒酵母中表達，就和釀酒酵母中已有的代謝途徑一起搭建起了完整的MAA合成途徑。
而困難版的“移花接木”，往往需要更廣泛的借鑒，比如斯坦福的工程師們曾經(jīng)在釀酒酵母中設(shè)計并搭建出了本來只存在罌粟中的阿片類藥物生產(chǎn)線，在搭建的過程中，她們總共向釀酒酵母中表達了多達20多個來源于植物、哺乳動物、細菌以及酵母菌本身的基因。
用7個物種來源的基因在釀酒酵母體內(nèi)設(shè)計并搭建的阿片類藥物合成途徑（圖片來源：中科院植物所北京植物園、 Science Photo Library、維基百科、Stephanie Galanie et al.,2015）
高級的設(shè)計理念是“無中生有”，專業(yè)化的表述叫做“反向合成”，這個策略適合那些結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生物合成途徑不清楚的化合物。
其大致過程是將復(fù)雜化合物可能的前體通過枚舉的方式列出來，再將其前體的前體列出來，重復(fù)這個步驟，直到列出的化合物是一個足夠簡單的化合物。此時會得到很多條從簡單到復(fù)雜的合成途徑，接下來就是尋找最優(yōu)途徑，找到后設(shè)計就算是完成了。
反向合成原理（圖片來源：Centre for Molecular and Biomolecular informatics）
第四階段：讓微生物細胞工廠更“皮實”
微生物細胞工廠作為有生命的個體，由于需要承受來自工程師的厚望，一般工程師會希望它們能夠“皮實”一些，對環(huán)境中的抑制因子不要過于敏感，比如希望它們在高效生產(chǎn)目標化學(xué)品的同時，還能夠抵抗生產(chǎn)過程中濃度產(chǎn)物對微生物的毒性等影響。
為了讓微生物變得更皮實，工程師一般會采用兩種手段：
如果對目標化合物產(chǎn)生毒性的分子機制很了解，工程師一般會對底盤微生物進行針對性的改造。比如：如果微生物分泌到細胞外的化合物再次回到細胞內(nèi)會對微生物有毒性時，工程師可以通過改造微生物，來堵死這種有毒化合物進入細胞的途徑；再比如目標產(chǎn)物在細胞內(nèi)濃度過高也會抑制微生物的生長時，增強微生物的對該化合物的轉(zhuǎn)出能力就是一種很好的解決策略；
如果對化合物毒性產(chǎn)生的機制不甚了解，工程師往往會采取簡單粗暴的篩選加改造。
這種方法叫做實驗室適應(yīng)性進化，就是把微生物放到含有毒性化合物的培養(yǎng)基中不斷的傳代，傳代過程中同時也逐漸增加毒性產(chǎn)物的濃度，最后在毒性化合物濃度最高的培養(yǎng)基中存活下來的微生物會被選擇出來，然后從基因組水平上去檢查它與之前有什么不同，找到能夠賦予抵抗毒性的關(guān)鍵突變，然后再對正常的微生物定向改造，即可獲得具有抗性的微生物。
不同條件下對微生物進行連續(xù)的馴化（圖片來源：Choi, K.R., et al., 2019）
第五階段：優(yōu)化“生產(chǎn)線”
評價一個微生物細胞工廠產(chǎn)化合物的過程是否有競爭力主要看三個參數(shù)，分別是：滴度（Titer），即目標產(chǎn)物的濃度；收率（Yield），即所得到每克目標化合物和所投入每克原料的比值；生產(chǎn)率（Productivity），即單位時間、體積或者單位細胞所生產(chǎn)目標產(chǎn)物量的比率。一般而言，這三個參數(shù)是越高越好，所以如果想要足夠高的效率和利潤，光有目標產(chǎn)物的代謝途徑是不夠的，還需要對“生產(chǎn)線”也就是代謝途徑進行優(yōu)化，確保生產(chǎn)目標產(chǎn)品的生產(chǎn)線能在微生物中更高效的運行。
細胞內(nèi)主要的代謝途徑（圖片來源：2003 International Union of Biochemistry and Molecular Biology）
對微生物有一些了解的人會知道，它們細胞內(nèi)部的代謝途徑其實是由很多條代謝途徑組成的復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)，只有對代謝網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性具有足夠的認識，改造起來才事半功倍。
目前，工程師可以方便的從基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組等多種組學(xué)水平去理解細胞內(nèi)的代謝網(wǎng)絡(luò)。對細胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)有了全貌性的了解之后，工程師就有底氣對內(nèi)源的代謝途徑做修改了，修改這些內(nèi)源的代謝途徑的指導(dǎo)原則主要是“開源節(jié)流”，即為增加目標化合物前體的供應(yīng)并避免目標化合物轉(zhuǎn)化成其它化合物。
第六階段：微生物細胞工廠的放大
對于工程師而言，前五個階段如果都能順利完成，也不一定能拿到錢，還需要一個從實驗室走向生產(chǎn)的關(guān)鍵過程——微生物細胞工廠的放大。
微生物細胞工廠的放大過程（來源：Yoo-Sung Ko et al., 2020）
工程師構(gòu)建好微生物細胞工廠后往往只會在實驗室對它進行性能測試，實驗室培養(yǎng)細胞工廠的規(guī)模往往在數(shù)百毫升到30升之間，測試性能達標后，還會在中試規(guī)模繼續(xù)進行驗證，中試規(guī)模培養(yǎng)微生物的反應(yīng)器容積往往在30到3000升之間，但這樣的規(guī)模相對于實際需求還是太小。
更大規(guī)模的實驗一般會由企業(yè)來做，先經(jīng)歷一個規(guī)模在3000到20000升的工藝驗證階段，仍然沒有問題后，就可以在20000到2000000升的運行規(guī)模中正式上崗，發(fā)光發(fā)熱了。
如何能夠成為生物工程師？
這六個階段都結(jié)束后，短期來看，開發(fā)工廠的工程師和企業(yè)可能會在大賺一筆，能夠填補由于前期研發(fā)“砸錢”消耗的元氣；長期來看，如果工程師和企業(yè)聯(lián)手能創(chuàng)造出更好、更有意義的的微生物細胞工廠，那么同樣的成本，產(chǎn)物供應(yīng)量相應(yīng)上升，最終消費者購買的價格則會有所降低。所以打造微生物細胞工廠，無論對生產(chǎn)者（工程師、企業(yè)）還是消費者（社會）都是具有重大意義的。不過就成本來看，目前要建這樣的“工廠”還是有很大的挑戰(zhàn)，新的技術(shù)是降低成本和縮短周期的關(guān)鍵，接下來的文章里會對一些先進生物技術(shù)進行深度解讀。
有些小伙伴看到生物工程師靠微生物細胞工廠走上致富之路，就也想效仿？
等等，你可千萬別急著入行，不妨再來看看你個人需要經(jīng)歷些什么才能靠這種模式賺錢吧！
首先需要經(jīng)歷系統(tǒng)、專業(yè)的訓(xùn)練，至少獲得一個與生物學(xué)相關(guān)的博士學(xué)位，成為一個優(yōu)秀的博士，對以上六個階段了然于胸的同時還得是某個細分領(lǐng)域的專家。在經(jīng)過調(diào)研確定下來一個有市場前景自己也能做的來的化合物之后，你還得能組織起一個擁有在這六個階段都有所長的研究人員的團隊，之后你的團隊可能還需要幾年的時間去攻關(guān)從微生物細胞工廠構(gòu)建到大規(guī)模應(yīng)用所面臨的所有問題，整個過程中你還需要充足的資金作為物質(zhì)基礎(chǔ)，這筆錢的數(shù)額大概會超過千萬美元。以上人力、物力及時間的成本是目前構(gòu)建出一個在經(jīng)濟上有競爭力，能滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求的微生物細胞工廠所需成本的平均水平。
參考文獻：
[1] 孫玉松，馮國梧，2017，《“億元教授”張學(xué)禮的背后》，科技日報
[2] Casini, A., et al., 2018. A Pressure Test to Make 10 Molecules in 90 Days: External Evaluation of Methods to Engineer Biology. J. Am. Chem. Soc. 140, 4302–4316.
[3] Choi, K.R., et al., 2019. Systems Metabolic Engineering Strategies: Integrating Systems and Synthetic Biology with Metabolic Engineering. Trends Biotechnol.
[4] Galanie, S., et al., 2015. Complete biosynthesis of opioids in yeast. Science (80-. ). 349, 1095 LP – 1100.
[5] Park, S.-H., et al., 2018. Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for Production of Shinorine, a Sunscreen Material, from Xylose. ACS Synth. Biol.
[6] Ko, Y.-S., et al., 2020. Tools and strategies of systems metabolic engineering for the development of microbial cell factories for chemical production. Chem. Soc. Rev. 49, 4615–4636.
[7] Jens, Nielsen, Jay D, Engineering Cellular Metabolism. Cell, 2016.
